La Klebsiella pneumonies tiene un regulon que se compone de 20 genes que suman 24 Kilobases. Se transcribe los genes de forma simultánea. Para la subunidad que forma la dinitrogenasa y las demás enzimas están presentes en el operon. La fijación del nitrógeno se regula a dos niveles: a nivel transcripcional debido a la presencia de oxigeno o la captación de nitrógeno. La segunda regulación es a nivel de la actividad de la dinitrogenasa  mediante el efecto conmutador del amoniaco, el amoniaco se une covalentemente a la dinitrogenasa que es un proceso reversible dependiente de la concentración de amoniaco. La capacidad de fijar nitrógeno se calcula mediante la relación entre la nitrogenasa que se basa en la enzima es la capacidad de reducir el acetileno que lo pasa etileno. Se detecta mediante cromatografía de gases. Es una medida indirecta, ya que las medidas directas no son fiables.

Tema 12: Regulación del metabolismo microbiano.

Debemos de tener un control estricto del metabolismo permitiendo el control de diferentes partes de la ruta. Las células deben adaptarse al cambio de nutrientes  y fuente de energía. Solo sintetizan enzimas necesarias para el catabolismo  de sustancias que producen el máximo rendimiento de entre los que halla en el ambiente. El control a nivel de transcripción mediante la expresión génica, a nivel traduccional debido a que la vida media del mensajero determina el tiempo de traducción modulando la concentración de enzima, a nivel postraduccional podemos encontrar proteínas que son precursoras de otras mediante la modulación de la eliminación de péptidos señal de membrana, autoprocesamiento de algunas proteínas en las que se elimina algunos fragmentos en los que podemos hablar de exteina e inteina como en el caso de intron y exon además de la síntesis de poliproteinas y la regulación a nivel de la actividad enzimática que es la regulación de las enzimas dependientes de sustrato.

La represión en el ADN es el paso entre heterocromatina y eucromatina.

El operon es un conjunto de genes que codifican para proteínas relacionadas que se transcriben en un único  mensajero. El operon expresa todos los genes a la vez. Los regulones son el agrupamiento de varios operones que son regulados por la misma proteína. El estimulon es un conjunto de regalones que están regulados por el mismo estimulo. Podemos regularlos dependiendo de una enzima alostérica que dependa de los efectos impidiendo o favoreciendo la transcripción. Con ello favorece o desfavorece la unión de la polimerasa. Si reduce el número de mensajeros que se forman se produce el proceso de atenuación. Controla que termine o no la transcripción de un gen. La regulación por factores sigmas alternativos  es otra forma de regulación. El factor sigma es un componente de la polimerasa. La célula tiene varias sigmas y dependiendo del número de determinados sigmas obtenemos unos ARN u otros.

En las proteínas reguladoras que inician la transcripción tenemos dos tipos:

 Control negativo: es en el que la proteína es un represor y la interacción con el ADN es en el operador  que se sitúa entre el promotor y los genes estructurales. Dentro del represor podemos encontrarlo que sea un operon inducible que son los operones que controlan el catabolismo de algunos nutrientes de manera que cuando esta presente el catabólico se sintetizan las enzimas, por lo que el operon da lugar a la inducción enzimática. En ausencia del catabólico se une el represor e impide la síntesis de ARN. El otro tipo es el control negativo que es el reprimible en el que en ausencia de la señal el represor no se une y el operon se transcribe normalmente. En presencia de la señal hay un compuesto que actúa como correpresor que se une al represor que cambia de conformación y se une al ADN. La ADN polimerasa no transcribe el operon. La represión es utilizada en la biosíntesis.

Otro tipo de control es la expresión génica que esta mediada por la concentración de los trifosfato. La célula se adapta a diversas circunstancias. El número de ribosomas se adapta al grado de crecimiento de la célula. Si el crecimiento es rápido se a necesitan mas ribosomas. Si la célula tiene muchos nutrientes tienen muchos trifosfato. Estos nucleótidos trifosfato son muy frecuentes en la zona de iniciación de la transcripción (ATP y GTP) del ARNr. Si hay muchos tenemos una alta síntesis de ARNr. Con esto tenemos altos niveles de transcripción por lo que el crecimiento será mayor. Una alta tasa  de traducción produce un mayor gasto de ATP y GTP. Se forma un circuito cerrado que modula la producción de crecimiento y ARN.

Existe el sistema global de control  que permite la regulación de varios operones que no tienen un regulon funcional, pero todos ellos responden a una misma señal específica. La represión catabólica consiste en que un gran número de enzimas catabólicas no se sintetizan siempre y cuando esta presente en el medio una fuente de carbono y energía que sea más asimilable se sintetizan las enzimas que catabolizan para esa sustancia y para ninguna más. La regulación catabólica por glucosa es un ejemplo. A través de regulación positiva medida por una proteína activadora que se une al ADN y media la transcripción. La proteína se denomina CAP (proteína activadora de catabolitos) para que se pueda unir es necesario que tenga AMPc y mientras haya glucosa la transcripción regulada por la proteína CAP no tendría lugar debido a que a una alta concentración de glucosa intracelular mantiene una baja concentración de AMPc intracelular y no alcanza el nivel necesario para alcanzar a CAP e interaccione con el ADN. Hay mecanismos de regulación adicionales. El Lac esta regulado por un propio represor y por este también. Otro sistema de regulación metabólica que se utiliza es el factor sigma específica. Las interacciones con el promotor están en las regiones -35 y -10 que son a las que se une el factor sigma. Dependiendo de la secuencia del promotor tendrá afinidad por una sigma u otro. En E. colí hay 7 distintos, el sigma 70 es el responsable de la mayoría de los genes. La respuesta al choque térmico se mide por el factor sigma 32 que se sintetiza en todo momento, pero tiene una vida media de 2 ó 3 minutos. Una vez pasado el tiempo se degrada, por lo que no entraría en el proceso de inicio de la transcripción. Sin embargo, si hay un choque térmico la situación cambia, debido a que la proteína DNAK que es la encargada de degradar el sigma y además es chaperona, dirige su actividad a la recuperación del plegamiento de muchas proteínas implicadas en el choque térmico, por lo que la concentración de sigma 32 aumenta y permite que se transcriba genes que recuperan a la célula del efecto térmico. Una vez que se ha recuperado la proteína sintetiza mas DNAK que degradan a los sigmas 32 y volvemos a la situación inicial. En la esporalizacion de Bacillus subtilis se produce por este sistema. La presencia en quórum es otro ejemplo, cuando la célula detecta individuos de la misma especie mediante la secreción de la derivación de AHL  que se secreta al medio y cuando consigue una concertación umbral se genera la respuesta. La bioluminiscencia es otro de los ejemplos.

Hay sistemas en los que no hay una relación entre la sustancia y la respuesta. Hay un receptor que recoge la sustancia y produce la sustancia que produce en el ADN la actuación o desactivación. Otro sistema de transducción de señales es el sistema EFC que regula señales extracelulares. Los factores sigma son diferentes y se cotranscriben con factores antisigma que produce la inactivacion. Forma un complejo de membrana que a respuesta de una señal se libera el factor sigma el cual transcribe el gen.

 Control positivo: esta mediado por una proteína activadora. En ausencia de señal no se transcribe el operon y cuando existe el compuesto actúa como inductor que facilita la interacción de la polimerasa con el promotor. El sitio de unión del inductor puede estar alojado en el promotor o lejos, a diferencia del represor. El inductor puede localizarse  en una región del ADN alejada. Un ejemplo es el operon maltosa.

La regulación por atenuación se produce cuando se inicia la transcripción, pero no se termina. Se estudio en E. colí, concretamente en el operon triptófano. Actúan dos tipos de control; un control de proteínas represoras y el control de atenuación. El operon suele tener varios tipos de control. Comienza a transcribirse la secuencia líder y se va traduciendo, ya que los dos procesos están acoplados. Dentro de la secuencia líder esta la secuencia atenuadora que codifica para dos triptófano, si la célula tiene triptófano se acopla a la región atenuadora produciendo que el ribosoma se coloque de tal forma que produce una secuencia con estructura secundaria en el mensajero que provoque el bloqueo de la transcripción. Se detiene el proceso. En el caso de que no haya triptófano se para el proceso de traducción, lo que el mensajero y el ribosoma cambian de posición cambiando el tipo de estructura  secundaria del mensajero, lo que produce que sigamos la transcripción. Muchos operones implicados en la síntesis tienen esta regulación. Modulamos más finamente la ausencia o presencia de un aminoácido. Esta atenuación se puede producir en operones de síntesis de pirimidina en el que se regulan las velocidades de transcripción, si se necesitan pirimidinas se disminuye la velocidad de transcripción y se aumenta el proceso de traducción. En las Gram. positivas también ocurre lo mismo que en E. coolí. En Bacillus no se acopla la transcripción y la traducción. La proteína reguladora modula el avance o no de la polimerasa.

La regulación del ARN antisentido es otra forma de regulación. La polimerasa sintetiza del 5´ al 3´. Hay secuencias que codifican para complementar el ARN mensajero que codifica genes. Introducen ARN y forman una doble cadena lo que bloquea la traducción. Hay muchos ejemplos: expresiones de porinas en E. coolí. Las porinas están en la membrana externa que dependiendo de la localización de las células obtenemos dos tipos de porinas: Omp F cuando hay una baja presión osmótica y la Omp G que se sintetiza cuando la presión osmótica es alta. Cuando aumenta la presión osmótica se sintetizan un ARN antisentido que bloquea el ARN  que codifica para Omp F cuando hay una baja presión osmótica y la Omp G se sintetiza cuando se bloquea el ARN que codifica Omp F. la replicación del plásmido de E. coolí es otro ejemplo. Esta modula la cantidad de cebador libre o unido. El plásmido es el Col I. dependiendo de la cantidad de cebador va a depender la transcripción del plásmido. Se puede controlar la transcripción y traducción del ADN. En la trascripción, el ADN va sintetizando el ARN. El ARN antisentido puede bloquear el proceso de transcripción. En eucariotas también aparece los ARN antisentido.

Tema 9: Esporulación. Formación de endosporas,

Las endosporas se forman dentro de la célula. Son muy impermeables a los colorantes. La estructura de la endospora tal como se ve al microscopio electrónico es muy diferente a la célula vegetativa. La capa mas externa es el exosporio, una fina y delicada cubierta de naturaleza proteica. Por debajo de está se encuentra la cubierta de la espora, que se compone de varias capas de proteínas especificas de las esporas. Por debajo esta el córtex, que no es mas que una capa de peptidoglicano con uniones laxas. Internamente, y por debajo del córtex, se presenta el núcleo o protopalsto de la espora, que contiene la pared celular normal. Un compuesto químico característico de la endospora y ausente en las células vegetativas, es el acido dipicolinico. Este compuesto se ha encontrado en todas las endosporas examinadas y se localiza en el núcleo de la espora.

Durante la formación de la endospora una célula vegetativa se convierte en una estructura inerte y termorresistente. La esporulación supone una compleja serie de procesos de diferenciación celular. La esporulación bacteriana no se produce durante el crecimiento exponencial, sino únicamente al cesar el crecimiento como consecuencia de la limitación de un nutriente esencial. Por esta razón, una bacteria típica formadora de endospora, como por ejemplo Bacillus, deja de crecer vegetativamente e inicia la esporulación tan pronto como se agota alguno de los nutrientes críticos, como la fuente de carbono o de nitrógeno.

La conversión de una célula vegetativa en endospora se basa en muchos cambios en la expresión de los genes de la célula. El proceso puede dividirse en varias fases. Mediante estudios genéticos se ha comprobado que hay alrededor de 200 genes implicados en la producción de endosporas. La esporulación requiere el cese de la síntesis de algunas proteínas funcionales en la célula vegetativa, y la síntesis de nuevas proteínas especificas. Esto se lleva a cabo mediante la activación de diversos genes como SPO, SSP que codifica las SASPs y muchos otros en respuesta a estímulos ambientales que inducen la esporulación.

Una endospora es capaz de permanecer en estado de latencia durante muchos años, incluso miles de años. Pero también se puede dar lugar a una célula vegetativa de un modo relativamente rápido. Este proceso ocurre en tres pasos: activación, germinación  y crecimiento.

 La activación se realiza fácilmente por el calentamiento de las endosporas formadas, durante varios minutos a una temperatura subletal pero elevada. Las endosporas activadas quedan así condicionadas a germinar cuando se colocan en presencia de los nutrientes adecuados.

 La germinación es normalmente un proceso rápido que ocurre en cuestión de minutos y supone la perdida de refringencia de la espora, un aumento en la capacidad de tinción por colorantes, y la perdida de la resistencia al calor y a sustancias químicas. En esta fase se produce la desaparición del dipicolinato calcico y de los componentes del córtex, y se degradan las SASPs.

 La siguiente fase es el crecimiento, se caracterizan por un hinchamiento visible de la célula debido a proteínas y ADN. Finalmente, la célula emerge una vez rota la cubierta de la endospora y se divide. La célula continua luego en crecimiento vegetativo hasta que nuevamente detecta señales ambientales que ponen en marcha la esporulación.

Bloque V: Crecimiento microbiano e influencia de los factores ambientales.

Tema 13: Crecimiento de poblaciones microbianas.

En microbiología, la palabra crecimiento se define como un incremento en el número de células. El crecimiento es un componente esencial en las células microbianas, ya que en la naturaleza cualquier célula tiene un periodo de vida finito y la especie se mantiene como consecuencia del crecimiento. El crecimiento también se puede medir como incremente de la masa celular.

La velocidad de crecimiento es el cambio en el numero de células o en la masa celular experimentado por unidad de tiempo. Durante el ciclo de división celular, todos los componentes estructurales de la célula se duplican. El intervalo para la formación de dos células a partir de una supone una generación, y el tiempo transcurridopara que esto ocurra se denomina tiempo de generación. Por tante el tiempo de generación es el tiempo que requiere para que la población se duplique, por lo que también se le denomina tiempo de duplicación.

El moedlo de incremento de la población, en el que cada periodo fijo de tiempo se duplican el numero de células se denomina crecimiento exponencial. Cuando en un sistema de coordenadas se representa arbitrariamente el numero de células de un experimento en función del tiempo transcurrido, se obtiene una curva cuya pendiente aumenta constantemente. Una característica del crecimiento exponencial es que la velocidad del aumento del numero de células es inicialmente lenta, pero incrementa cada vez mas con el tiempo. Esto determina que en las ultimas etapas el aumento del numero de células sea realmente explosivo.

El aumento en el numero de células que se produce en un cultivo bacteriano creciendo exponencialmentes es una progresión geometrica de la base 2. cuando dos células se dividen producen cuatro y esto se puede espresar como que el crecimiento es igual a 2ⁿ, siendo n el numero de generaciones. Debido a esta progresión geometrica, existe una relación directa ente el numero de células presentes inicalmente y el numero presentes tras un periodo de crecimiento exponencial.

N=N₀2ⁿ

Siendo N el numero final de células, N₀ el numero inicial de células y n igual a numero de generaciones que han ocurrido. El tiempo de generación g de la poblacio celular se calcula como t/n donde t es el tiempo de crecimiento exponencial. Por tanto sabiendo en numero inicial y final de células en una población que esta creciendo exponencialmente, es posible calcular n y conociendo n y t podemos calcular g.

El tiempo de generación también se puede calcular a partir de la pendiente de la recta obtenida en la expresión semilogaritmica del crecieminto exponencial.