Tema 2: Observación de microorganismos.

Para el estudio de la microbiología se precisa de la microscopia. Podemos distinguir dos tipos de microscopia que son la óptica y la electrónica. La óptica utiliza como amplificación un juego de lentes, esta se basa en que un haz de luz pasa a trabes del condensador, iluminando el objeto y este llega al objetivo que crea una imagen invertida y esta pasa al ocular en la que la vemos del derecho. La microscopia electrónica cambia las lentes ópticas por un juego de lentes electromagnéticas que provocan el aumento.

La microscopia óptica: el aumento de este tipo de microscopia se basa en la curvatura de las lentes y la distancia focal. Aparecen dos puntos focales, uno es la F que es el foco que se crea en la imagen y la F` que es el foco que se crea en el ocular. La distancia entre los focos depende de las curvaturas de las lentes. Cuanto mas cerca esta el objetivo del punto focal mayor  es el aumento. El ojo funciona como un sistema de lentes, pero este tiene un límite que impide que podamos ver los microorganismos a simple vista. El primer microscopio fue inventado por Leevenhock que vio imágenes nítidas del mundo procariotas dibujándolos y difundiéndolos. Pasaron muchos años hasta que se pudieron repetir estos estudios, hasta que se desarrollo el microscopio óptico compuesto. En la actualidad el microscopio óptico lleva incluida un sistema de tres lentes que son el condensador, objetivo y ocular. Este microscopio se denomina de campo abierto. El condensador hace pasar el haz de luz a través del objeto, este queda iluminado y crea la imagen e el objetivo, pasando posteriormente al ocular y recibida por el ojo humano. Podemos encontrar tres tipos de objetivos según sus aumentos que son: el de 10x, 40x y 100x. Además tenemos dos oculares que son el de 5 y el de 10. Para mirar al microscopio debemos tener en cuenta el poder de resolución  y el grado de contraste de la muestra. El poder de resolución es la capacidad de la lente de producir dos imágenes que están situadas muy cerca. El límite de resolución  “d” es igual a 0´5λ/senα siendo λ la longitud de onda con la que iluminamos la muestra. El índice de refracción es n, normalmente es uno ya que es el aire. El índice de refracción por el senα se denomina apertura numérica, cuanto menor limite de resolución mayor resolución. La resolución se consigue cambiando la longitud de onda con lo que se aumenta el poder de resolución. Cuando la fuente de luz es luz ultravioleta no la vemos, por lo que el microscopio debe de llevar incorporada una cámara fotográfica. Además de esta cámara debemos considerar que las lentes son de cuarzo ya que el vidrio es opaco a la luz ultravioleta. El límite de resolución disminuye aumentando el índice de refracción, mediante el cambio de medio, como por ejemplo colocar aceite de inmersión. Con ello conseguíos ver un tamaño mínimo de 200nm. Para menores tamaños se utiliza el microscopio electrónico. El grado de contraste depende de la transmisión de la luz en mayor o menor cantidad que viene visto porque la luz sea absorbida o refractada.

La observación es máxima cuando la muestra es coloreada y si el índice de refracción varia. La coloración se consigue con la tensión que suele matar la muestra. El microscopio especial aumenta el contraste sin tensión de la muestra. Estos microscopios son, por ejemplo, el de campo oscuro que se diferencia porque posee entre la luz y la lente condensadora un disco opaco que solo deja pasar un anillo de luz. La luz que lo atraviesa lo hace con un ángulo determinado viendo un fondo negro sobre el que aparece un objeto luminoso o brillante.

El microcopio de contraste de fases es otro tipo de microcopio que permite ver mejor las células. Cuando el haz pasa por la muestra modifica el índice de refracción y la longitud de onda. Con este microcopio se aumenta la diferencia de fases, con lo que se aumenta el contraste. Esto se consigue que se desfasen ½ las ondas que producen la interferencia y no se ve luz en el punto consiguiendo un mayor grado de contraste. Para conseguir necesitamos que el microcopio tenga el disco opaco colocado por debajo del condensador y la placa de fases esta situada entre el objetivo y el ocular. Con ello se consigue el desfase de las ondas de luz.

El microcopio de fluorescencia es otro microcopio que es la modificación del microscopio de luz ultravioleta. Con ello hemos conseguido aumentar el contraste. El funcionamiento se basa en la fluorescencia de algunos objetos en la naturaleza. La muestra capta la luz ultravioleta y la pasa a luz visible, ya que la absorbe y emite una luz de menor energía que ya si es visible. La lente del condensador debe de ser de cuarzo. Nosotros vemos la fluorescencia de la muestra. No se necesita la cámara fotográfica. Si se añaden además colorantes fluorescentes se vera mejor. A estos colorantes se les denomina fluorocromos. Hay una técnica muy utilizada denominada inmunofluorescencia que es acoplar a un anticuerpo de fluorescencia para reconocer una cepa determinada en una muestra. En la actualidad la microscopia más compleja permite ver las muestras en 3d. Estos son los microscopios de contraste de interferencia diferencial. Es muy parecido al microcopio de fases, ya que tiene el mismo sistema para utilizar la luz polarizada, pero este la proyecta sobre un prisma el cual genera dos haces  que cambian de fase a través de la muestra generando el fenómeno de interferencia. Se pueden observar orgánulos en eucariotas y gránulos en procariotas. El microcopio de sonda de barrido que proporciona una gran nitidez. En este tipo podemos distinguir dos tipos que son: el de fuerza atómica que posee una aguja muy fina que actúa como sonda de la muestra que es rastreada generando fuerzas de repulsión  entre la muestra y la aguja modificando la inclinación que es recogida por un rayo láser y lo envía a un ordenador y se puede crear la imagen. Se asemeja a la microcopia electrónica, pero permite ver muestras naturales, que no han sido tratadas. El otro tipo de microcopio de barrido es el microcopio con focal con luz láser que sale por un orificio muy fino. Tiene una capacidad de campo de 1 μ. Esta acoplado a un ordenador que obtiene cortes ópticos que se integran en una imagen 3d. Esto permite que podamos elegir la orientación de donde queremos que se observe la muestra. Es muy útil para los biofilos que es un depósito de procariotas sobre una superficie.

Preparación de las muestras;

La preparación de las muestras puede ser de dos formas: en fresco y con tinción. En fresco es simplemente la suspensión celular en un medio acuoso. Con ello vemos el organismo vivo. Sobre una gota se coloca un cubre objetos. Conseguimos ver la morfología y el movimiento del organismo.

En tinción implica la muerte celular, alterando la morfología con los que se aumenta el contraste. Hacemos un frotis que es una película muy fina de la muestra y lo fijamos con calor o con agentes químicos en eucariotas. Se aplica el colorante que es un cromóforo que establece relación iónica con la muestra con cargas positivas en básicos y con negativas en ácidos. Los ácidos se unen a lo básico y los básicos a lo acido.

Se basa en las propiedades iónicas. Se añaden mordientes que establecen una mayor relación entre el colorante y la muestra. Los tipos son:

      tinción simple: Aumentamos el contraste de la muestra. El proceso comprende el frotis, tinción, secado y lavado.

      tinción negativa: Se tiñe el medio. Vemos a las células en oscuro, el contorno brillante sobre un fondo negro. Con ello se distinguen mejor que con la tinción positiva. Se utiliza colorantes no afines por el material celular. Se usa tinta china. El proceso consiste en aplicar el tinte y dejar secar.

      tinción diferencial: Se distinguen entre tipos celulares. Un ejemplo de este tipo es la tinción Gram., que aun continua vigente. Sirve como un sirviente taxonómico, aunque no es universal, pero para la gran mayoría si. El proceso consiste en una tinción primaria con el colorante cristal violeta que tiñe toda la célula. Se añade el mordiente que es el lugol. Se lava la tinción con etanol de modo que las Gram. + quedan teñidas y las Gram. – pierden la tinción. La tinción secundaria es con safranina. Este método se basa e el tipo de pared, ya que las Gram. + tienen una pared celular gruesa compuesta por peptidoglicanos y las Gram. – tienen una pared fina con lípidos que se destiñen con el alcohol y las positivas aun se afine mas con la deshidratación producida por el alcohol. Otro tipo de tinción dentro de la diferencial es acido-alcohol que sirve para la tinción de los microorganismos Mycobacterium y Nocardice, se basa en que la bacteria tiene acido micolico en la pared que se tiñen muy mal y cuando se tiñen se pierde muy mal el colorante. Tiene dos tinciones; la primera  es con fucsina que tiñe todas las células de color fusia, se produce el lavado con acido y alcohol que se decoloran las células de reacción negativas y damos la segunda tinción que es de contraste con el colorante azul de metilo.

tinción especiales: Ponen de manifiesto los orgánulos. Podemos encontrar la tinción de capsulas que son para destacar la presencia de la capsida que significa virulencia. Suelen estar hidratadas que destacan dos tipos de tinción: tinción negativa mas la tinción simple que pone de manifiesto la capsida y la tinción simple tiñe alrededor de la célula, tras un lavado con sulfato cubrico. La tinción de endosporas es un tipo de tinción especial que se caracteriza por estar deshidratada que presenta una pared que tiñe muy mal, utilizando la tinción diferencial que se compone de una tinción primaria con el verde malaquita que se aplica con calor, por ejemplo en el genero Bacillus. Se lava co agua en el que las células pierden el color y quedando teñidas las endosporas. Aplicamos la segunda tinción con safranina, que es de contraste. El último tipo es la tinción de flagelos, en el que los flagelos son invisibles para el microcopio óptico, se le añade el mordiente para fijar los flagelos y se tiñen con fucsina.

Microscopia electrónica;

La microscopia electrónica debemos de deshidratar la muestra en la que meteremos plástico liquido que saca el agua y cuando solidifica queda duro y se pueden hacer secciones con el ultramicrotomo. Se coloca sobre una rejilla permeable a los electrones. Hay técnicas específicas de tinción que son:

       Sombreado metálico: se cubre la muestra con una película de platino con un ángulo de 45º sobre la muestra. Se deposita sobre una parte y sobre otra no. Con ello conseguimos una vista 3d. se ve fimbrias y flagelos, además de virus.

      Criofractura: también denominado criograbado. Se congela la muestra con nitrógeno líquido y se permite calentar hasta 100º C, con lo que el agua se evapora sin modificar la estructura de la muestra. Cubrimos con una película de platino y carbón, no si n antes someter a fractura con lo que se rompe respetando los orgánulos y estructuras. Se destruye el material celular quedando el carbono como una mascara, viendo la estructura interna de la célula.

El microscopio electrónico de barrido  hace un sondeo de la superficie de la muestra. Permite obtener imágenes tridimensionales, no hay sección de la muestra y se tiñen con sales de oro o de platino. Permite una gran profundidad de campo. El límite de resolución es de 10nm. Llega a diez mil aumentos. Se basa en que el haz de electrones incide sobre la muestra y arranca electrones que son detectados por el detector. Estos electrones se les denominan electrones secundarios. El número de electrones secundarios depende de la exposición de la muestra hacia el haz. Cuanto mayor exposición, mayor numero de electrones se desprenden. Cuanto mayor ángulo, mayor nitidez se consigue, ya que se desprenden un mayor numero de electrones.

Microbiología significa el tratado de pequeños organismos, concibiendo pequeño como aquello que nos son percibidos por el ojo humano.

Hasta la invención del microscopio no se pudo desarrollar esta ciencia. Leevenhock invento el microscopio de una sola lente, con el que observaba diferentes objetos. Comunico sus estudios a Londres a una asociación de científicos establecidos allí en el que describió bacterias, espermatozoides, hongos… Este es el nacimiento de la microbiología. Robert Hocke descubrió la célula, con el microscopio compuesto que no igualo al de una sola lente, ya que aparecían aberraciones. Entre 1723 y 1820 no hubo avances, hasta 1920 que se avanzo en el microscopio. Los científicos se preguntaros sobre el origen de estos microorganismos y se plantearon dos teorías; la primera es la de generación espontánea, lo que quiere decir que venían de objetos inertes y la segunda teoría es la que decían que venían de otros seres vivos. La teoría de generación espontánea es la más seguida desde la época de Platón, incluso en el renacimiento que sustituyeron las leyes ocultas por las leyes de movimiento.

Un medico planteo el experimento de que si dejaba carne fuera aparecían gusanos, pero estos no aparecen si esta carne es tapada con una gasa. Con esto demostró que no había generación espontánea, aunque esta teoría no fue descartada. Los que estaban a favor de la generación espontánea se refugiaban en los microorganismos. Para descartar esta teoría, Lázaro Palanzani, calentó la muestra y cerro el bote herméticamente, impidiendo que los microorganismos entraran, diciendo que no se creaba generación espontánea. Un clérigo ingles dijo que al faltar oxigeno, por culpa del cierre hermético, no se puede crear vida. Sulf y Svaln hicieron el experimento pero incluyendo una fuente de oxigeno y no se crearon microorganismos, pero se hizo en una época en la que impera el vitalismo, esta decía que el calor actúa sobre la fuerza vital e impide la vida, por lo que estos experimentos no demostraba nada. Se planteo el experimento pero incluyendo en vez de calor un filtro de algodón y salía excepto con las infusiones de heno. Pucheff propuso un experimento a favor de la generación espontánea. Pasteur dio el golpe definitivo haciendo los experimentos en matraz de cuello de cisne, quedando los microorganismos en el cuello y no pasan a la infusión. Con esto se demostró que no había generación espontánea. Se puso la pega de que con el heno si aparecían. En el heno hay muchos bacilos, esporas de hongos que no son matadas por el calor, si estas esporas se creaban por las bacterias no se matan y aparecen en las infusiones. Con esto aparecen dos tipos de bacterias que son las que son la forma que es resistente al calor y la que no.  La forma resistente al calor es termorresistente.

Los científicos vieron la relación entre el cambio de sustancias en las infusiones. Esto era debido al crecimiento de la población de microorganismos. Definen dos cambios que son la fermentación y la putrefacción. La putrefacción olía mal debido a contener carne la infusión. La fermentación se debía  a la aparición de alcoholes en las infusiones vegetales. El experimento mas destacado fue el que definió que la levadura era la responsable de la fermentación. Un químico, Pasteur se enfrento a sus compañeros, ya que la bioquímica decía que la fermentación y putrefacción son procesos simples sin la presencia de organismos vivos. Pasteur resolvió el problema de la elaboración del vino, ya que los que elaboraban el vino se quejaban de que aparecían olores y descomposición del vino que se estropeaba. Pasteur observo la fermentación alcohólica en la que se producía acido láctico en vez de etanol. Las levaduras de la fermentación alcohólica fueron sustituidas por bacterias que producían acido láctico. Relaciono el crecimiento de un tipo de organismo con el tipo de fermentación que se obtenía.

El ambiente también influía, ya que si añadimos tiza que es carbonato calcico se sube el pH y crecían bacterias que producen el acido láctico y si bajamos el pH aparecen las levaduras que producen la fermentación alcohólica. La especificidad de la fermentación debía tener un estudio sistemático de muchas fermentaciones. El estudio de la fermentación butílica puso de manifiesto la presencia de la vida anaerobia (sin oxigeno). La fermentación es la acción específica. No es precisa la presencia de los microorganismos para la fermentación, simplemente con una parte de los microorganismos es preciso. En la naturaleza la reacción la realizan los organismos. La especificidad se demostró gracias a los cultivos puros en los que se inoculan con una muestra de suelo. Aparecen microorganismos que alteran el medio, con ello aparecen otros microorganismos al cambio de ambiente. Esto dio pie al pleomorfismos, un individuo puede presentar varias formas. Pasteur defiende el monomorfismo, además de la especificidad.

Coock estudio el carbunco en ratones, que trasmitía la enfermedad a ratones con la extracción e inoculación de sangre. Con ello vio que los animales que morían tenían en la sangre unos bastoncillos que eran los que producían el carbunco. Hizo un estudio sistemático de las enfermedades, desarrollo un método de individualización de bacterias para destacarlas.

Brezol individualizo esporas. Mediante diluciones se puede individualizar hasta llegar a un solo microorganismo en la dilución. Coock observo que la aparición de colonias en las patatas. Las colonias eran diferentes, pero dentro de una misma colonia todas las células eran iguales y diferentes entre las colonias. Para separarlas se coge una patata y se pasa a otra. Con ello se consigue aislar los diferentes tipos. La demostración de que todas las células de una colonia sean igual es poner una extensión de una colonia y verlo al microscopio. En el caso de que sean mixtas obtendrá dos tipos. Con esto demostraron que si son iguales al pasarlo o aislarlo da el mismo organismo. La implicación biológica es que se quedo claro el concepto de microorganismo. Se destruyo la teoría del polimorfismo. No solo probaron con el carbunco, sino también con la tuberculosis. Estableció los siguientes postulados:

1)      El microorganismo sospechoso debe de estar presente en todos los casos de enfermedades y ausente en los animales sanos.

2)      El microorganismo sospechoso debía ser aislado a cultivo puro. Aparecen colonias aisladas que pueden crear nuevas colonias

3)      Células de un cultivo puro se inocula en un animal debe causar la muerte del animal sano.

4)      El organismo debe de ser reaislado del animal demostrando que es igual al original.

Ya no se utilizaba la patata, Coock  las sustituyo por otro, ya que esta presentaba desventajas como son la humedad, es opaca y algunos no crecen bien. Utilizaba gelatina  la que añade al medio de cultivo, pero tubo el problema de la temperatura, ya que es liquida a 28ºC. Además al ser una proteína es degradada por las bacterias. Se utilizo un polisacárido que es un agente solidificarte que se utilizaba en oriente medio, este agar tiene la propiedad de que se funde a 100ºC u permanece líquido hasta los 44ºC, esto propicia que a esta temperatura se desarrollen las bacterias, es resistente a la gran mayoría de las bacterias y es transparente.

Además se introdujo la placa de petri gracias a un estudiante de Coock. El agar fundido se coloca en la placa petri. También se introduce la aguja de platino que puede ser esterilizada con la que se puede transportar de una colonia al medio. U cultivo puro es un clon. Descubren los microorganismos  que producen los procesos geoquímicas. Los quimiolitotroficos crecen sobre un medio inorgánico y utilizan el dióxido de carbono como fuente de energía, son bacterias que pasan el sulfhídrico a sulfato, el nitrito a nitrato…

Se descubren las bacterias que estabilizan el nitrógeno inerte, pasándolo a nitrógeno utilizable. Esto se hace gracias a la selección natural, en un suelo en el que no había nitrogeno se producen microorganismos de estos pasaos a un matraz y así se van seleccionado hasta quedar únicamente este tipo de bacterias. Este es un cultivo de enriquecimiento de bacterias. Demuestra que los microorganismos son los que participan en los ciclos de la naturaleza. La inmunológica fue otro descubrimiento. Pasteur aisló el cólera que lo inyectaba en gallinas y se mueren, pero el día que lo presentaba no se morían y pensó que había utilizado un cultivo viejo. Reinocula a estas gallinas con el cólera y no morían y las control si. Descubrió las vacunas. Vio que al envejecer el cultivo pierde su virulencia y al inocularlo este presenta inmunidad. La virulencia es otro adelanto que se descubrió con el virus de tabaco. Se descubrió que había virus que atacaban a animales y bacterias, además de las plantas.

La microbiología se preocupo del estudio de los microorganismos. La biología se implica en la célula y su función. En 1920 se observo la relación entre microorganismos y los seres superiores, ya que aparece el concepto de unidad química. En el caso de bacterias no había sexualidad, por lo que no había parecido, pero la genética los vuelve a unir mediante un experimento de mutantes de hongos. La alteración de numerosas enzimas se relaciona con el fenotipo que presenten. Descubren la mutación espontánea. En 1944 descubren la transformación que esta mediada por el ADN. Demostró que el carácter esta escrito en el ADN. Se descubrió el microscopio electrónico. En los cincuenta se descubrió la estructura del ADN, control de enzimas, inducción y represión. En los setenta aparece la clonación del gen. En los ochenta se descubrió que aparece el tercer reino que da origen al nuevo árbol genealógico.