Una endospora es capaz de permanecer en estado de latencia durante muchos años, incluso miles de años. Pero también se puede dar lugar a una célula vegetativa de un modo relativamente rápido. Este proceso ocurre en tres pasos: activación, germinación  y crecimiento.

 La activación se realiza fácilmente por el calentamiento de las endosporas formadas, durante varios minutos a una temperatura subletal pero elevada. Las endosporas activadas quedan así condicionadas a germinar cuando se colocan en presencia de los nutrientes adecuados.

 La germinación es normalmente un proceso rápido que ocurre en cuestión de minutos y supone la perdida de refringencia de la espora, un aumento en la capacidad de tinción por colorantes, y la perdida de la resistencia al calor y a sustancias químicas. En esta fase se produce la desaparición del dipicolinato calcico y de los componentes del córtex, y se degradan las SASPs.

 La siguiente fase es el crecimiento, se caracterizan por un hinchamiento visible de la célula debido a proteínas y ADN. Finalmente, la célula emerge una vez rota la cubierta de la endospora y se divide. La célula continua luego en crecimiento vegetativo hasta que nuevamente detecta señales ambientales que ponen en marcha la esporulación.

Bloque V: Crecimiento microbiano e influencia de los factores ambientales.

Tema 13: Crecimiento de poblaciones microbianas.

En microbiología, la palabra crecimiento se define como un incremento en el número de células. El crecimiento es un componente esencial en las células microbianas, ya que en la naturaleza cualquier célula tiene un periodo de vida finito y la especie se mantiene como consecuencia del crecimiento. El crecimiento también se puede medir como incremente de la masa celular.

La velocidad de crecimiento es el cambio en el numero de células o en la masa celular experimentado por unidad de tiempo. Durante el ciclo de división celular, todos los componentes estructurales de la célula se duplican. El intervalo para la formación de dos células a partir de una supone una generación, y el tiempo transcurridopara que esto ocurra se denomina tiempo de generación. Por tante el tiempo de generación es el tiempo que requiere para que la población se duplique, por lo que también se le denomina tiempo de duplicación.

El moedlo de incremento de la población, en el que cada periodo fijo de tiempo se duplican el numero de células se denomina crecimiento exponencial. Cuando en un sistema de coordenadas se representa arbitrariamente el numero de células de un experimento en función del tiempo transcurrido, se obtiene una curva cuya pendiente aumenta constantemente. Una característica del crecimiento exponencial es que la velocidad del aumento del numero de células es inicialmente lenta, pero incrementa cada vez mas con el tiempo. Esto determina que en las ultimas etapas el aumento del numero de células sea realmente explosivo.

El aumento en el numero de células que se produce en un cultivo bacteriano creciendo exponencialmentes es una progresión geometrica de la base 2. cuando dos células se dividen producen cuatro y esto se puede espresar como que el crecimiento es igual a 2ⁿ, siendo n el numero de generaciones. Debido a esta progresión geometrica, existe una relación directa ente el numero de células presentes inicalmente y el numero presentes tras un periodo de crecimiento exponencial.

N=N₀2ⁿ

Siendo N el numero final de células, N₀ el numero inicial de células y n igual a numero de generaciones que han ocurrido. El tiempo de generación g de la poblacio celular se calcula como t/n donde t es el tiempo de crecimiento exponencial. Por tanto sabiendo en numero inicial y final de células en una población que esta creciendo exponencialmente, es posible calcular n y conociendo n y t podemos calcular g.

El tiempo de generación también se puede calcular a partir de la pendiente de la recta obtenida en la expresión semilogaritmica del crecieminto exponencial. 

Otro índice de la velocidad de crecimiento es la cosntante de velocidad de crecimiento, que se denomina como k. se expresa como  y tiene unidades en horas^-1. Mientras que g es una medida de tiempo que tarda una población de duplicarse, k es una medida del numero de generaciones que ocurren por unidad de tiempo en un cultivo exponencial. Si disponemos de los valores de n y t , se puede calcular g y k para diferentes microorganismos.

El crecimiento de poblaciones se mide estimando los cambios en el numero de células, en la cantidad de algún componente de las mismas o en el peso total de las mismas. Existen varios metodos cara contar el numero de células o determinar la masa celular. Estos son:

 Recuento de células totales: el numero de células de una población de puede determinar contando una muestra con el microscopio con el método de recuento directo. Se puede hacer de dos formas, en muestras secas sobre portas y en muestras liquidas. Con muestras liqueidas se utilizan camaras de recuento especiales, en esencia son portas escabados modificados, cobre cuya superficie de vidrio est marcado una regilla con determinados cuadrados de área conocida. El recuento directo con el microscopio es un método rápido para conocer el numero de células, si embargo presenta diversas limitaciones como, no distingue las células vivas de las muertas, las células pequeñas son difíciles de ver, la precision es difícil, se requiere un micorcopio de contranste de fases cuando la muestra no se tiñen y el método no suele ser adecuado para suspesiones con baja densidad celular.

 Recuento de células viables: en el recuento microscopico directo se cuentan tanto células vivas como muertas. En muchos casos interesa contar solo células vivas. Una célula viable se define como aquella que es capaz de dividirse y dar lugar a una descendencia y el método ideal para determinar se basa en contar el numero de células en la muestra capaz de formar colonias aobre un medio solido adecuado, por esta razón se llama recuento en placa o receunto de colonnias. Este procedimiento se supone que cada célula viable puede formar una colonia. Hay dos maneras de realizar un receunto en placas para viables, el método de extensión en placas y el método en vertido en placa. En los dos metodos señalados anteriormente es importante que el numero de colonias que aparezcan en las placas no sea demasiado grande, pues algunas colonias se podrian fusionar dando estimaciones erroneas, también es importante que el numero de colonias no sea demasiado bajo, para que el calculo sea estadísticamente significativo. En la practica el numero de colonias por placa oscila entre 30 y 300. para obtener el numero apropiado de colonias se diluye la muestra.

Tema 2: Observación de microorganismos.

Para el estudio de la microbiología se precisa de la microscopia. Podemos distinguir dos tipos de microscopia que son la óptica y la electrónica. La óptica utiliza como amplificación un juego de lentes, esta se basa en que un haz de luz pasa a trabes del condensador, iluminando el objeto y este llega al objetivo que crea una imagen invertida y esta pasa al ocular en la que la vemos del derecho. La microscopia electrónica cambia las lentes ópticas por un juego de lentes electromagnéticas que provocan el aumento.

La microscopia óptica: el aumento de este tipo de microscopia se basa en la curvatura de las lentes y la distancia focal. Aparecen dos puntos focales, uno es la F que es el foco que se crea en la imagen y la F` que es el foco que se crea en el ocular. La distancia entre los focos depende de las curvaturas de las lentes. Cuanto mas cerca esta el objetivo del punto focal mayor  es el aumento. El ojo funciona como un sistema de lentes, pero este tiene un límite que impide que podamos ver los microorganismos a simple vista. El primer microscopio fue inventado por Leevenhock que vio imágenes nítidas del mundo procariotas dibujándolos y difundiéndolos. Pasaron muchos años hasta que se pudieron repetir estos estudios, hasta que se desarrollo el microscopio óptico compuesto. En la actualidad el microscopio óptico lleva incluida un sistema de tres lentes que son el condensador, objetivo y ocular. Este microscopio se denomina de campo abierto. El condensador hace pasar el haz de luz a través del objeto, este queda iluminado y crea la imagen e el objetivo, pasando posteriormente al ocular y recibida por el ojo humano. Podemos encontrar tres tipos de objetivos según sus aumentos que son: el de 10x, 40x y 100x. Además tenemos dos oculares que son el de 5 y el de 10. Para mirar al microscopio debemos tener en cuenta el poder de resolución  y el grado de contraste de la muestra. El poder de resolución es la capacidad de la lente de producir dos imágenes que están situadas muy cerca. El límite de resolución  “d” es igual a 0´5λ/senα siendo λ la longitud de onda con la que iluminamos la muestra. El índice de refracción es n, normalmente es uno ya que es el aire. El índice de refracción por el senα se denomina apertura numérica, cuanto menor limite de resolución mayor resolución. La resolución se consigue cambiando la longitud de onda con lo que se aumenta el poder de resolución. Cuando la fuente de luz es luz ultravioleta no la vemos, por lo que el microscopio debe de llevar incorporada una cámara fotográfica. Además de esta cámara debemos considerar que las lentes son de cuarzo ya que el vidrio es opaco a la luz ultravioleta. El límite de resolución disminuye aumentando el índice de refracción, mediante el cambio de medio, como por ejemplo colocar aceite de inmersión. Con ello conseguíos ver un tamaño mínimo de 200nm. Para menores tamaños se utiliza el microscopio electrónico. El grado de contraste depende de la transmisión de la luz en mayor o menor cantidad que viene visto porque la luz sea absorbida o refractada.

La observación es máxima cuando la muestra es coloreada y si el índice de refracción varia. La coloración se consigue con la tensión que suele matar la muestra. El microscopio especial aumenta el contraste sin tensión de la muestra. Estos microscopios son, por ejemplo, el de campo oscuro que se diferencia porque posee entre la luz y la lente condensadora un disco opaco que solo deja pasar un anillo de luz. La luz que lo atraviesa lo hace con un ángulo determinado viendo un fondo negro sobre el que aparece un objeto luminoso o brillante.

El microcopio de contraste de fases es otro tipo de microcopio que permite ver mejor las células. Cuando el haz pasa por la muestra modifica el índice de refracción y la longitud de onda. Con este microcopio se aumenta la diferencia de fases, con lo que se aumenta el contraste. Esto se consigue que se desfasen ½ las ondas que producen la interferencia y no se ve luz en el punto consiguiendo un mayor grado de contraste. Para conseguir necesitamos que el microcopio tenga el disco opaco colocado por debajo del condensador y la placa de fases esta situada entre el objetivo y el ocular. Con ello se consigue el desfase de las ondas de luz.

El microcopio de fluorescencia es otro microcopio que es la modificación del microscopio de luz ultravioleta. Con ello hemos conseguido aumentar el contraste. El funcionamiento se basa en la fluorescencia de algunos objetos en la naturaleza. La muestra capta la luz ultravioleta y la pasa a luz visible, ya que la absorbe y emite una luz de menor energía que ya si es visible. La lente del condensador debe de ser de cuarzo. Nosotros vemos la fluorescencia de la muestra. No se necesita la cámara fotográfica. Si se añaden además colorantes fluorescentes se vera mejor. A estos colorantes se les denomina fluorocromos. Hay una técnica muy utilizada denominada inmunofluorescencia que es acoplar a un anticuerpo de fluorescencia para reconocer una cepa determinada en una muestra. En la actualidad la microscopia más compleja permite ver las muestras en 3d. Estos son los microscopios de contraste de interferencia diferencial. Es muy parecido al microcopio de fases, ya que tiene el mismo sistema para utilizar la luz polarizada, pero este la proyecta sobre un prisma el cual genera dos haces  que cambian de fase a través de la muestra generando el fenómeno de interferencia. Se pueden observar orgánulos en eucariotas y gránulos en procariotas. El microcopio de sonda de barrido que proporciona una gran nitidez. En este tipo podemos distinguir dos tipos que son: el de fuerza atómica que posee una aguja muy fina que actúa como sonda de la muestra que es rastreada generando fuerzas de repulsión  entre la muestra y la aguja modificando la inclinación que es recogida por un rayo láser y lo envía a un ordenador y se puede crear la imagen. Se asemeja a la microcopia electrónica, pero permite ver muestras naturales, que no han sido tratadas. El otro tipo de microcopio de barrido es el microcopio con focal con luz láser que sale por un orificio muy fino. Tiene una capacidad de campo de 1 μ. Esta acoplado a un ordenador que obtiene cortes ópticos que se integran en una imagen 3d. Esto permite que podamos elegir la orientación de donde queremos que se observe la muestra. Es muy útil para los biofilos que es un depósito de procariotas sobre una superficie.

Preparación de las muestras;

La preparación de las muestras puede ser de dos formas: en fresco y con tinción. En fresco es simplemente la suspensión celular en un medio acuoso. Con ello vemos el organismo vivo. Sobre una gota se coloca un cubre objetos. Conseguimos ver la morfología y el movimiento del organismo.

En tinción implica la muerte celular, alterando la morfología con los que se aumenta el contraste. Hacemos un frotis que es una película muy fina de la muestra y lo fijamos con calor o con agentes químicos en eucariotas. Se aplica el colorante que es un cromóforo que establece relación iónica con la muestra con cargas positivas en básicos y con negativas en ácidos. Los ácidos se unen a lo básico y los básicos a lo acido.

Se basa en las propiedades iónicas. Se añaden mordientes que establecen una mayor relación entre el colorante y la muestra. Los tipos son:

      tinción simple: Aumentamos el contraste de la muestra. El proceso comprende el frotis, tinción, secado y lavado.

      tinción negativa: Se tiñe el medio. Vemos a las células en oscuro, el contorno brillante sobre un fondo negro. Con ello se distinguen mejor que con la tinción positiva. Se utiliza colorantes no afines por el material celular. Se usa tinta china. El proceso consiste en aplicar el tinte y dejar secar.

      tinción diferencial: Se distinguen entre tipos celulares. Un ejemplo de este tipo es la tinción Gram., que aun continua vigente. Sirve como un sirviente taxonómico, aunque no es universal, pero para la gran mayoría si. El proceso consiste en una tinción primaria con el colorante cristal violeta que tiñe toda la célula. Se añade el mordiente que es el lugol. Se lava la tinción con etanol de modo que las Gram. + quedan teñidas y las Gram. – pierden la tinción. La tinción secundaria es con safranina. Este método se basa e el tipo de pared, ya que las Gram. + tienen una pared celular gruesa compuesta por peptidoglicanos y las Gram. – tienen una pared fina con lípidos que se destiñen con el alcohol y las positivas aun se afine mas con la deshidratación producida por el alcohol. Otro tipo de tinción dentro de la diferencial es acido-alcohol que sirve para la tinción de los microorganismos Mycobacterium y Nocardice, se basa en que la bacteria tiene acido micolico en la pared que se tiñen muy mal y cuando se tiñen se pierde muy mal el colorante. Tiene dos tinciones; la primera  es con fucsina que tiñe todas las células de color fusia, se produce el lavado con acido y alcohol que se decoloran las células de reacción negativas y damos la segunda tinción que es de contraste con el colorante azul de metilo.

tinción especiales: Ponen de manifiesto los orgánulos. Podemos encontrar la tinción de capsulas que son para destacar la presencia de la capsida que significa virulencia. Suelen estar hidratadas que destacan dos tipos de tinción: tinción negativa mas la tinción simple que pone de manifiesto la capsida y la tinción simple tiñe alrededor de la célula, tras un lavado con sulfato cubrico. La tinción de endosporas es un tipo de tinción especial que se caracteriza por estar deshidratada que presenta una pared que tiñe muy mal, utilizando la tinción diferencial que se compone de una tinción primaria con el verde malaquita que se aplica con calor, por ejemplo en el genero Bacillus. Se lava co agua en el que las células pierden el color y quedando teñidas las endosporas. Aplicamos la segunda tinción con safranina, que es de contraste. El último tipo es la tinción de flagelos, en el que los flagelos son invisibles para el microcopio óptico, se le añade el mordiente para fijar los flagelos y se tiñen con fucsina.

Microscopia electrónica;

La microscopia electrónica debemos de deshidratar la muestra en la que meteremos plástico liquido que saca el agua y cuando solidifica queda duro y se pueden hacer secciones con el ultramicrotomo. Se coloca sobre una rejilla permeable a los electrones. Hay técnicas específicas de tinción que son:

       Sombreado metálico: se cubre la muestra con una película de platino con un ángulo de 45º sobre la muestra. Se deposita sobre una parte y sobre otra no. Con ello conseguimos una vista 3d. se ve fimbrias y flagelos, además de virus.

      Criofractura: también denominado criograbado. Se congela la muestra con nitrógeno líquido y se permite calentar hasta 100º C, con lo que el agua se evapora sin modificar la estructura de la muestra. Cubrimos con una película de platino y carbón, no si n antes someter a fractura con lo que se rompe respetando los orgánulos y estructuras. Se destruye el material celular quedando el carbono como una mascara, viendo la estructura interna de la célula.

El microscopio electrónico de barrido  hace un sondeo de la superficie de la muestra. Permite obtener imágenes tridimensionales, no hay sección de la muestra y se tiñen con sales de oro o de platino. Permite una gran profundidad de campo. El límite de resolución es de 10nm. Llega a diez mil aumentos. Se basa en que el haz de electrones incide sobre la muestra y arranca electrones que son detectados por el detector. Estos electrones se les denominan electrones secundarios. El número de electrones secundarios depende de la exposición de la muestra hacia el haz. Cuanto mayor exposición, mayor numero de electrones se desprenden. Cuanto mayor ángulo, mayor nitidez se consigue, ya que se desprenden un mayor numero de electrones.